Munur á milli breytinga „DNA-raðgreining“

ekkert breytingarágrip
Aðferðin byggir á því að DNA fjölliðunarhvarf er sett af stað. Í hvarfinu eru auk venjulegra hvarfefna einnig til staðar breytt núkleótíð, [[ddNTP]]. Þegar ddNTP er sett inn í röðina í stað [[dNTP]] stöðvast fjölliðunin því á ddNTP-ið vantar OH-hóp sem er nauðsynlegur fyrir hvarfið. Þar sem ddNTP-ið er sett inn á handahófskenndum stöðum fást að lokum allar mögulegar styttri útgáfur af upprunalega bútnum. Raðirnar eru svo aðskildar eftir stærð með rafdrætti. Áður fyrr voru einfaldlega sett af stað 4 mismunandi hvörf, eitt fyrir hvert núkleótíð. Síðan var rafdregið á geli. Nú eru yfirleitt notast við flúrmerkt ddNTP og rafdregið í örpíplum. Hægt er að raðgreina um 1000 basa langa röð með Sanger-raðgreiningu en algengast er að fá 500-700 basa raðir.
 
==Háafkasta raðgreining DNA==
==Úrvinnsla Sanger raðgreiningar==
Háafkasta raðgreining ([http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_sequencing#High-throughput_sequencing high-throughput sequencing]) vísar til iðnvæðingar DNA raðgreininga. Á tíunda áratug 20. aldarinnar urðu framfarir í Sanger-raðgreiningu sem uku afköst og gerðu ferlið sjálfvirkt að miklu leiti. Helstu framfarirnar voru að:
*Byrjað var að nota flúrmerkt ddNTP.
*Rafdregið er í örpíplum á stað gels og hægt er að raðgreina mörg sýni í einu með nútíma Sanger-raðgreiningartækjum.
*Sýni voru rafdregið framhjá leysergeisla og skanna í stað þess að rafdraga á geli.
*Hreinsun og fjölliðunarhvarfið sjálft voru bætt t.d. með betri fjölliðunarensímum.
 
==Úrvinnsla Sanger raðgreiningarraðgreininga==
Nútildags er algengast að Sanger raðgreiningar séu framkvæmdar í örpíplum og að svokallaðar "trace" skrár séu búnar til. Í þeim er skráður styrkur þeirra fjögurra basa sem notaðir eru við DNA nýmyndun hvers DNA móts (template) fyrir sig.
* trace
Phred er forrit sem les inn flúrmælingar (trace files) og ákvarðar basaröð úr Sanger-raðgreingu. Hver basi fær einnig gæðaeinkunn.
Phrap er forrit til að raða saman stöku röðum (reads) í contig í búta raðgreingu (shotgun sequencing). Phrap notast við gæðaeinkunina frá Phred þegar raðað er saman.
Þegar frumgögnin hafa verið unnin fæst FASTA röð fyrir hvern raðgreindan DNA bút. Þessar raðir má síðan vinna með, t.d. að raða saman í [[samfella|samfellu]] (contig), og byggja upp heilstæða mynd af genum og erfðamengjum.
 
==Næsta kynslóð DNA raðgreininga (Next generation sequencing).==
==Háafkasta raðgreining DNA==
Háafkasta raðgreining ([http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_sequencing#High-throughput_sequencing high-throughput sequencing]) vísar til iðnvæðingar DNA raðgreininga. Á tíunda áratug 20. aldarinnar urðu framfarir í Sanger-raðgreiningu sem uku afköst og gerðu ferlið sjálfvirkt að miklu leiti. Helstu framfarirnar voru að:
*Byrjað var að nota flúrmerkt ddNTP.
*Rafdregið er í örpíplum á stað gels og hægt er að raðgreina mörg sýni í einu með nútíma Sanger-raðgreiningartækjum.
*Sýni voru rafdregið framhjá leysergeisla og skanna í stað þess að rafdraga á geli.
*Hreinsun og fjölliðunarhvarfið sjálft voru bætt t.d. með betri fjölliðunarensímum.
 
Næsta kynslóð DNA raðgreininga (Next generation sequencing).
Með erfðamengjaöldinni urðu miklar framfarir í DNA raðgreiningu, en ljóst var að Sanger-raðgreiningaraðferðin var ekki endilega sú besta. Í kjölfarið byrjaði tímabil mikillar grósku, margskonar nýjar aðferðir komust á koppinn og sumar í brúk. Oft er talað um næstu kynslóð DNA raðgreiningaaðferða, sem byggja á öðrum lögmálum en Sanger-raðgreining. Nokkrar slíkar eru komnar í almenna notkun. Miða þær allar að því að auka afköst og minnka kostnað við raðgreiningu. Nokkur dæmi eru:
*Raðgreiningu með basapörun, sem er aðferð til skoða breytileika í erfðamengjum sem hafa þegar verið raðgreind. Hægt er að skoða hvora samsætuna af ákveðnum SNP einstaklingur hefur með þessari aðferð.
*Verið er að þróa aðferðir sem geta lesið lengri DNA-búta og á ódýrari hátt en þekkist í dag. Raðgreining með nanopores eða öropum er aðferð þar sem breyting í rafstraumi í miðu opsins þegar basi fer í gegnum það gerir mönnum kleift að finna út röðina.
* Þær aðferðir sem lengst eru komnar, eru 454 raðgreining, Illumia-raðgreining og [http://en.wikipedia.org/wiki/ABI_SOLiD ABI SOLiD raðgreining].
Úrvinnsla gagna úr þessum nýju raðgreiningaaðferðum fer eftir því hvaða tækni er notuð. Úrvinnsla SOLiD gagnanna er t.d. mjög sérstök á meðan raðir úr 454 og Illumina má meðhöndla á svipaðan hátt og FASTA skrár, og byggja úr þeim [[samfella|samfellur]].
 
==Illumina-raðgreining==
Óskráður notandi