„DNA-raðgreining“: Munur á milli breytinga
Efni eytt Efni bætt við
Ekkert breytingarágrip |
|||
Lína 4:
==Sanger raðgreining==
Aðferðin byggir á því að DNA fjölliðunarhvarf er sett af stað. Í hvarfinu eru auk venjulegra hvarfefna einnig til staðar breytt núkleótíð, [[ddNTP]]. Þegar ddNTP er sett inn í röðina í stað [[dNTP]] stöðvast fjölliðunin því á ddNTP-ið vantar OH-hóp sem er nauðsynlegur fyrir hvarfið. Þar sem ddNTP-ið er sett inn á handahófskenndum stöðum fást að lokum allar mögulegar styttri útgáfur af upprunalega bútnum. Raðirnar eru svo aðskildar eftir stærð með rafdrætti. Áður fyrr voru einfaldlega sett af stað 4 mismunandi hvörf, eitt fyrir hvert núkleótíð. Síðan var rafdregið á geli. Nú eru yfirleitt notast við flúrmerkt ddNTP og rafdregið í örpíplum. Hægt er að raðgreina um 1000 basa langa röð með Sanger-raðgreiningu en algengast er að fá 500-700 basa raðir.
Nútildags er algengast að Sanger raðgreiningar séu framkvæmdar í örpíplum og að svokallaðar "trace" skrár séu búnar til. Í þeim er skráður styrkur þeirra fjögurra basa sem notaðir eru við DNA nýmyndun hvers DNA móts (template) fyrir sig.
=trace= er skrá sem inniheldur mælingar á flúrljómum þegar raðgreint er með nútíma Sanger-raðgreiningu.
=Basakall (Base calling) =
eða ,,basa ákvörðun” er þegar DNA röð er ákveðinn út frá flúrmælingum í Sanger raðgreiningu. Flúrmælingin er lesin úr svokallaðri ,,trace file”. Yfirleitt er notast við sjálfvirka hugbúnað en einnig er hægt að ákvarða röðina handvirkt.
=Phred-Phrap=
Phred er forrit sem les inn flúrmælingar (trace files) og ákvarðar basaröð úr Sanger-raðgreingu. Hver basi fær einnig gæðaeinkunn.
Phrap er forrit til að raða saman stöku röðum (reads) í contig í búta raðgreingu (shotgun sequencing). Phrap notast við gæðaeinkunina frá Phred þegar raðað er saman.
==Háafkasta raðgreining DNA==
| |||